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一名记者的CRISPR初体验:连傻瓜都会使用因编辑工具

本文摘要:我对生物学涉及科学知识有一定理解,但当我查询新的基因编辑技术CRISPR涉及科学知识的时候,我却有些望而却步,该技术看上去非常复杂!但一位研究人员告诉他我,CRISPR(全称clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)只是听得一起可怕,用一起非常简单,傻瓜都能用。我自指出还是比傻瓜聪慧得多,之后想检验一下这句话的真假。 于是,我就无聊地开始了我的CRISPR初体验。

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我对生物学涉及科学知识有一定理解,但当我查询新的基因编辑技术CRISPR涉及科学知识的时候,我却有些望而却步,该技术看上去非常复杂!但一位研究人员告诉他我,CRISPR(全称clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)只是听得一起可怕,用一起非常简单,傻瓜都能用。我自指出还是比傻瓜聪慧得多,之后想检验一下这句话的真假。  于是,我就无聊地开始了我的CRISPR初体验。

  涉及资料表明,CRISPR在遏止或敲除基因上效果最佳,因此我想试用CRISPR来敲除基因。我原作了一个宏伟的目标:用CRISPR敲除一个免疫系统基因,我庞加莱,敲除该基因,可以增加Zika病毒所导致的损害。一旦顺利,这将大大推展Zika病毒涉及研究!(我的假设是,如果某个个体曾病毒感染过登革热,并有该病毒的抗体,那么CD32有可能有助驱动Zika病毒的自我复制。

)  RolandWagner是加州圣地亚哥SanfordBurnhamPrebys医学找到研究所SumitChanda实验室的博士后,他表示同意兼任我的CRISPR指导员。Wagner来自奥地利,是一个经验丰富的攀岩爱好者,讨厌有条不紊地已完成工作。他查询分析了CD32基因的序列,CD32具备五个有所不同的蛋白质编码区。

如果我们切割成其中一个蛋白编码区的DNA,该基因最有可能被敲除它将仍然传达CD32蛋白。生物学家RolandWagner(左)指导JonCohen展开建构CRISPR系统  CRISPR用于一行RNA将分子剪刀CRISPR的一部分,Cas9导向到基因组中的准确位点。我们可以卖到一行RNA(gRNA),但Wagner并不想这么腊。他认为,他不确认gRNA的价格是多少,但假设出售gRNA要花上500美元,他们自己制备,就只要5美金。

  gRNA序列能与我们想切割成的CD32基因上的一段长度为20个核苷酸的序列有序。但是,基因组中的其它地方也有可能不存在与这段短序列一样宽的片段,并不会造成分子剪刀切割成错误的位点。这种脱靶效应不会相当严重地影响实验结果,避免脱靶效应是研究CRISPR的关键目标。为了使CRISPR极具特异性,在靶向的20个核苷酸外,Cas9还必须一段额外的序列:N-G-G,其中N可以是任何核苷酸。

当Cas9在20个目标核苷酸后找到N-G-G时,马上融合并关上DNA双螺旋,随后gRNA与目标序列结合。最后Cas9切割成DNA的两条链。

  为了制做gRNA,Wagner把我们检验的CD32序列粘贴到免费数据库OptimizedCRISPRDesign中,查询凸挨着N-G-G的、合乎我们拒绝的20个核苷酸序列。CD32中有41个附加片段。

数据库扫瞄整个人类基因组,检查否其它地方也不存在完全相同的序列潜在的脱靶位点。我们自由选择了一个仅有不存在于CD32中的序列。然后Wagner关上另一个网站,采购该段DNA序列。

  DNA序列报废了,我第一次尝试了用于移液枪。自从我30多年前毕业以来,我就没在实验室工作过。那时,我学会了一种有可能是由LouisPasteur发明者的移液技术:我把一根手指放到我的嘴里,然后把一种化学品吸食到一个厚的玻璃管里,吸足了量后,就用指尖捂住玻璃管。


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